枯草菌、シリカゲルをまとう

メリークリスマス!しまふくろうです。
#今年読んだ一番好きな論文2021 に今年もエントリーしました。

今回紹介する論文はこちらです。

doi.org

あれこれ悩んだ末にサムネイルがキャッチーだったので、今月でた論文を紹介することにしました。

自己組織化するタンパク質と枯草菌を改造し、二酸化ケイ素(シリカ)をミネラル化(鉱化, シリカゲル形成)させるをデザインしたという論文です。

背景

Engineered Living Materials (ELMs. 日本語だと人工生物材料?)」をご存知でしょうか?

「機能性のある材料を組み立てることができ、環境応答可能な生きた細胞からなる生物材料」のことを指し、合成生物学と材料科学の融合領域の研究として注目されています (かっこいい説明はこちら. 英語)。

本論文の著者らは、ELMsの新たな可能性を探究するため、枯草菌 (Bacillus subtilis)を生きた細胞として選び、自己集合するタンパク質を分泌することで細胞間の結合 & シリカの鉱化 (シリカゲル形成)に取り組みました。

材料 & システムの紹介

枯草菌 (Bacillus subtilis) (図1-a)

今回のモデル生物。納豆菌 (Bacillus subtilis natto)もこの種の中に属している。

枯草菌のここがすごい!

1. 産業的に利用されており、安全性が一般に認められている

2. タンパク質の分泌能力が高い

3. 芽胞を形成し休眠することで過酷な環境でも生き延びることが可能

枯草菌のここがダメ!

1. 芽胞形成の時に細胞が壊れてしまう

2. ゲノム上にない遺伝子の変異率が高い (考察で議論)

EtuMタンパク質 (図1-b)

細菌由来のタンパク質。6分子集まることで二次元格子構造を形成する。本論文では細胞外にこのタンパク質を分泌する。

二酸化ケイ素 (シリカ)

自然界に豊富にみられるミネラル。(”シリカ"で検索すると怪しい水がたくさん出てくる)

SpyCatcher / SpyTag システム (図1-c)

SpyCatcherタンパク質 (SpyC)とSpyTagが自発的に共有結合することを利用し、SpyTagが結合したタンパク質とSpyCatcherが結合したタンパク質同士を結合させるツール。

シリカミネラルペプチド

シリカをミネラル化させる触媒作用のあるペプチド(短いタンパク質)。天然に知られている配列や人工的に設計されたものが既に知られている。天然のものは骨格や殻の形成に利用されている。

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図1. 材料および本論文で登場するシステム

 

研究内容

本論文の研究では、著者らは以下の4つの事を取り組んでいます(図2)。一つずつ紹介していきます。

1. 製造システムの設計 (Fabrication)

2. シリカのミネラル化と枯草菌の結合 (Assembly)

3. ELMの設計(Biocomposite)

4. ELMの再生 (Regeneration)

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図2. 枯草菌を用いたシリカ-枯草菌複合材料の形成 (紹介論文から引用)

1. 製造システムの設計 (fabrication)

まず著者らは、枯草菌の中で作られたEtuMSpyCを細胞外に放出することを目指しました。EtuMを細胞外に出すためのシグナルペプチドSacB (郵便番号のようなもの. これがついていると細胞外に放出される)をEtuMに付加し、EtuMが細胞外に放出されることを確認しました。

次に、枯草菌の改変を行いました。「枯草菌のここがダメ!」で書いた通り、枯草菌は芽胞形成と同時に細胞が分解されてしまいます。そこで、芽胞形成時に細胞を分解してしまう酵素lyt Cの遺伝子を欠損させました。また、べん毛の密度が減らして細胞同士の過剰な凝集を防ぐため、べん毛の形成に関わる遺伝子 (flhG)を欠失させました。この二つの変異を持つ枯草菌 (ΔlytC ΔflhG)は芽胞形成時に細胞が分解されず、また両端からのみべん毛が生えていることを確認しました (図3)。

さらに、細胞外に放出したEutMSpyCと枯草菌を結合するために、べん毛タンパク質フラジェリンへのSpyTagの導入を試みました。フラジェリンの9箇所の候補部位にそれぞれSpyTagを導入し、べん毛を形成でき、細胞外に存在するEutMSpyCと結合したフラジェリン変異体の設計に成功しました。

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図3: 枯草菌の改造 (紹介論文から抜粋)。a) 遺伝子欠失による枯草菌の変化の模式図。b) EutMSpyC発現プラスミドを持った枯草菌の、野生型 (WT)と変異体の比較。上の画像は芽胞形成で、変異体は芽胞(緑)が形成されても枯草菌の形状が維持されている。下の画像はべん毛の違いを見ており、側面から生えるべん毛が変異体では見られない。

2. シリカのミネラル化と枯草菌の結合 (Assembly)

シリカのミネラル化

EutMによってシリカをミネラル化するために、シリカのミネラル化機能を持つ既知のペプチドをEutMと融合させ、シリカの析出が見られる組み合わせを探索しました。四種類のペプチドとEutMの融合タンパク質を設計し、試験管内の実験でCotBペプチドを含むEutMが最も鉱化シリカ量が多いことを発見しました。設計したタンパク質を1で設計した枯草菌に生産させ、細胞外に放出させることで、シリカゲルのミネラル化が確認されました (図4)。このミネラル化されたシリカゲルをさらに固化し、シリカゲルブロックの成形にも成功しています。

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図4. 枯草菌によるシリカのミネラル化 (紹介論文より抜粋)。100 mMシリカの添加後、1時間でシリカのミネラル化が確認された。コントロール含めた全ての条件でミネラル化が見られているのは、枯草菌の細胞表面に存在するタンパク質等の影響であると著者らは主張している。

3. ELMの設計(Biocomposite)

シリカゲルのミネラル化と枯草菌の結合に成功した筆者らは、ゲルの機能化を目指しました。具体的には、紫色のタンパク質を発現させた枯草菌をシリカゲルの中に閉じ込めることで、紫色のシリカゲルを作製しました (図5)。

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図5. 枯草菌の共培養によるシリカの機能化 (紹介論文の図の改変). EutMCotBだけでは紫色のシリカが見られない (上)が、EutMSpyC発現の枯草菌を加えると紫のシリカが確認された (下)。右端は紫色シリカを成形物 (15 mm × 30 mm)

4. ELMの再生 (Regeneration)

ELMsは材料を成形した後も生きているので、破損等に対して自己再生することが期待されています。そこで著者らはこのELMが自己修復可能かを検証しました。シリカゲルの一部を切り取り、1日かけてシリカを固化させました。その後、新しい培地に移し2日間培養した結果、タンパク質の生産誘導をかけることによりEutMタンパク質の細胞外への放出およびシリカのミネラル化が確認されました。これらの結果はシリカ物質内でも枯草菌が生存しており、材料生産能を維持していることを示しています。

しかし、さらに長期間のシリカ固化の後同様の実験を行ったところ、EutMの細胞外への放出が確認できませんでした。この原因の一つとして、プラスミドにコードされたEutM遺伝子に変異が入ってしまったことが挙げられました(枯草菌のここがダメ2)。

 

【感想】(後で加筆)

面白かった点

  • 枯草菌を生かしたまま材料として使ってしまうアプローチが面白いと思いました。実は今回の紹介論文で初めてELMsを知ったのですが、今後の発展に目が離せないですね!
  • 本筋を失いそうになるほど様々な条件検討を重ねていて、著者らの苦労が感じられました。

難しいと感じた点

  • 実際の材料生産で使っていくにはまだまだ改良が必要そう。100 mMのシリカ濃度もかなり濃いため、より低濃度で設計できるかが今後の課題。
  • 遺伝子組み換え微生物の扱いが応用する上でネック。環境中に放てないので、作った材料を使える場所が難しい...
  • 合成生物学と材料科学の境界分野だけに、材料科学サイドの内容があまりわからなかったです。融合分野ムズカシイネ

参考資料(後で加筆)

ELMsに興味持った方へ (英語)

Dr. Blake Bextine, Engineered Living Materials (ELM) (DARPA)

Rodrigo-Navarro, A., Sankaran, S., Dalby, M.J. et al. Engineered living biomaterials. Nat Rev Mater 6, 1175–1190 (2021). 

 

番外編: 紹介するか迷った論文

  1. D. Mishra, T. Bepler, B. Teague, B. Berger, J. Broach, R. Weiss, An engineered protein-phosphorylation toggle network with implications for endogenous network discovery. Science (80-. ). 373 (2021)
    タンパク質リン酸化を利用したtoggle switchを設計した論文。興味がドンピシャ。
  2. C. Fan, Q. Deng, T. F. Zhu, Bioorthogonal information storage in l-DNA with a high-fidelity mirror-image Pfu DNA polymerase. Nat. Biotechnol. 39, 1548–1555 (2021).
    鏡像異性体でできたPfuポリメラーゼを設計し、天然に存在しないL体DNAの複製を行った論文。暗号の選び方がクール。Researchat.fm さんでも紹介されていました

    ( 111. Mirror Image Biology | Researchat.fm)。

翻訳後修飾つくってワクワク!ベンジル化リジン修飾-認識のタンパク質セットの設計 #今年読んだ一番好きな論文2020

*この記事は今年読んだ一番好きな論文Advent calender2020の12/20の記事です。

2021/12/20 改定

 

こんにちは、南の島で大学院生をしているしまふくろう (@is1andowl)と申します。

この企画を機にはてブを開設しました。いつも論文紹介ツールを悩んでしまうので、これからはこのブログを使って行こうと思います。

さて、今回紹介する論文はこちらです。

Arora, S., Horne, W. S. & Islam, K. Engineering Methyllysine Writers and Readers for Allele-Specific Regulation of Protein-Protein Interactions. J. Am. Chem. Soc. 141, 15466–15470 (2019).  https://doi.org/10.1021/jacs.9b05725

PMCで全文読めます. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988089/

 

一文まとめ

リジンベンジル化酵素とその修飾認識タンパク質のセットをBump-and-hole法で設計した。

前提となる予備知識

DNAからRNAに情報が読み取られたのち(転写)、RNA上の情報をもとにタンパク質が作られます(翻訳)。ここで作られたタンパク質がそのまま機能を発揮できるわけではなく、さらにパーツをつけることで本来の機能を発揮する(あるいは抑制される)ことがあります。このパーツのことを翻訳後修飾と呼びます。

この翻訳後修飾を作り出すものをライター (writer)認識するものをリーダー (reader)、消去するものをイレイサー(eraser. 今回は登場しません)とそれぞれ呼びます。

今回紹介する論文は、アミノ酸のリジンをメチル化するメチル化酵素(ライタータンパク質)と、その認識タンパク質(リーダータンパク質)の改変に関する研究です。

ヒトにおいて、約60種類のリジンメチル化酵素 (KMT) と200種類以上のリジンメチル化認識ドメインを持つタンパク質によって、5000箇所以上のメチル化リジンサイトの構築と認識に寄与しているといわれています。しかし、どのメチル化リジンがどのような細胞内ネットワーク制御に重要であるかはまだ十分に明らかにされていません。

この論文では、メチル化の代わりに自然界に存在しない修飾を導入できるライタータンパク質を設計し、その修飾だけを認識できるリーダータンパク質をセットとして設計できれば、他のシステムに影響を及ぼすことなくと考えました (Figure 1)。メチル化酵素はS-アデノシルメチオニン(SAM)と呼ばれる補酵素からメチル基を転移させるのですが、このメチル基の部分を他の化学修飾に変えることで、メチル化以外の修飾を導入することができます。

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Figure 1. Bump-and-holeシステムによるメチル化酵素/メチル化認識酵素の改変

J. AM. CHEM. SOC. 2019, 141, 39, 15466–15470. COPYRIGHT © 2019, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY

では、どのようにタンパク質の機能を改変するのでしょうか?タンパク質の機能改変のアプローチをざっくりと分けると、(1) 立体構造や機能ベースの合理的改変、(2) 進化分子工学などランダム変異による機能改変、(3)計算機を駆使したタンパク質デザインの3種類に区分できます。

この論文では、(1)の中でもBump-and-hole法(凹凸法)*1という戦略で機能改変を行いました。

Bump-and-hole法(凹凸法)とは?

bump-and-hole法は,ある特定のリガンド (bump)を認識するために、変異によってタンパク質側にそれが入るための空間 (hole)を作ることで、タンパク質とリガンドの直交した対を作製する方法です。と書いてもピンとこないのでFigure 2をご覧ください。

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Figure 2. Bump-and-hole法. 
天然のタンパク質が認識できないリガンド(bump)を認識できるようにタンパク質(hole)を改変する。これによって人工リガンドと人工タンパク質のみで機能する組み合わせを構築する。

本論文の筆者らは、まずライタータンパク質とその補酵素酵素の機能に必要な分子)の改変を行い(タンパク質-リガンド相互作用部位)、非天然の修飾を持つペプチドとリーダータンパク質の改変(タンパク質-タンパク質相互作用部位)を行いました (Figure 2)。

 

前置きが長くなりましたが、結果の方に移っていきましょう。

ライター / リーダータンパク質の改変

このグループが改変を試みたのは、メチル化酵素G9a (ライター)とメチル化認識タンパク質CBX1(リーダー)の組み合わせです。G9aはヒストン3*2というタンパク質の9番目のアミノ酸のリジンをトリメチル化します。以後この修飾をH3K9me3と書きます。

このグループは過去にメチル化酵素G9aの変異体(Y1154A)を作製し、蛍光色素TAMRAをH3K9に導入することに成功していました。筆者らはこの変異体のタンパク質内の空間をさらに拡張(Y1154G)し、SAMの代わりにベンジル化S-アデノシルメチオニン(SAM-bn)を補酵素として使用できるように改変しました。こうしてメチル化の代わりにベンジル化を触媒する酵素の設計に成功したのです。以後このベンジル化タンパク質(あるいはペプチド)上の非天然修飾をH3K9bnと書きます。

次に、メチル化認識タンパク質CBX1の基質認識に関わるアミノ酸を置換し、本来の基質であるトリメチル化されたH3K9me3を認識せず、H3K9bnを認識できる変異を探索したました。その結果、CBX1のY26F/F50G変異体はH3K9me3 (Kd = ∼80 μM)よりもH3K9bn (Kd = 5.5 ± 0.9 μM)に高い選択性を示しました (約14倍の選択性)。選択性が決していいわけではないのですが、一応H3K9bnを選択的に認識するリーダータンパク質の設計に成功しました。このCBX1 Y26F/F50G変異体とH3K9bnの共結晶構造解析から、タンパク質内のポケットが大きくなったことでベンジル基を認識することができたということがわかりました (Figure 3)。bump-and-hole法がうまく機能したわけです。

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Figure 3. CBX1-H3K9me3の共結晶構造 (左. PDB ID: 6D07)とCBX1 Y26F/F50G-H3K9me3の共結晶構造 (右. PDB ID: 6D08)の比較. 紹介論文Figure 3C, 3Dより抜粋
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なお、今回変異を加えたG9aの1154番目のチロシン残基とCBX1の50番目のフェニルアラニン残基は、他のメチル化酵素あるいはメチル化認識タンパク質で保存されていました。そこで他のタンパク質に同様の部位に変異を加えることで、ベンジル化反応する改変メチル化酵素やH3K9bnペプチド認識タンパク質の作製に成功しました。試している数は少ないですが、認識部位の配列(や立体構造)が似ていれば、bump-and-hole法が他のタンパク質にも適用できうることの好例になっています。

改変CBX1と細胞内タンパク質の相互作用

改変CBX1タンパク質単体ではH3K9bnペプチドに対する選択的な結合が見られましたが、他の因子が含まれる細胞抽出液でも機能するのでしょうか? 筆者らは、ヒト胎児腎細胞HEK293Tに発現させたHAタグ付き-CBX1 Y26F/F50G変異体が、in vitroでベンジル化リジンペプチドを選択的に認識できるかをテストしました。このタンパク質が含まれている細胞の核画分を抽出し、トリメチル化あるいはベンジル化ペプチドと結合したタンパク質を回収しました (より詳細に書くと、biotin化ペプチドを用いたbiotin-avidinのプルダウンをしています)。その結果、改変型CBX1はH3K9me3ペプチドやその他のトリメチル化ペプチドとの結合はほとんど確認できませんでしたが(Figure 4B, C)、H3K9bnペプチドでプルダウンしたときにはHAタグ由来のバンドが確認されました(Figure 4B)。このことから、改変CBX1は細胞抽出液においてもH3K9bnを認識していると示唆されました。

最後に、今回作成されたCBX1タンパク質が果たしてメチル化ネットワークを解析する有用なツールとして利用できるのかを検証しています。CBX1タンパク質は転写制御因子のTIF1βと相互作用することがすでに知られていました。そこで、H3K9bnペプチドと結合した改変CBX1を回収したときに、TIF1βも一緒に発見されるかを調べたところ、仮説通りCBX1-H3K9bnの組み合わせでTIF1βを検出することができました (Figure 4D)。

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Figure 4. CBX1 Y26F/F50G変異体を発現する細胞抽出液での実験

A. 実験系の説明. 核画分から抽出したタンパク質を修飾ペプチドと混ぜ、結合したタンパク質のみを精製した。B. 細胞内に元々存在するCBXタンパク質はH3K9me3ペプチドに選択的に結合し、改変CBX1はH3K9bnペプチドにだけ結合した. C. 改変CBX1は他のトリメチル化ペプチドとは相互作用をほとんどしなかった。D. 改変CBX1は野生型CBX1の結合相手であるTIFβとも相互作用した。

J. AM. CHEM. SOC. 2019, 141, 39, 15466–15470. COPYRIGHT © 2019, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY

感想

「人工翻訳後修飾の修飾/認識セットを作り、それで制御されるシステムを作りたい」というのが研究における大きな興味の一つで、まさにやってみたい研究をしている論文でした。bump-and-hole法で酵素ポケットを広げて人工補酵素や基質を認識させることや、人工リガンドを認識するタンパク質を設計する研究はいろいろある印象ですが、翻訳後修飾酵素-認識タンパク質のセットを作ったところが個人的推しポイントです。

今後大きなチャレンジがあるとすれば、細胞内での修飾/認識ができる系が作れるかだと思っています。安定的に人工補酵素(ここではSAM誘導体)を細胞内に供給するのは簡単ではなく、本論文でもあくまで細胞外に取り出してきて反応あるいは修飾認識の実験しか行えていません。細胞内での修飾/認識のシステムが作れると(個人的には)より面白い展開になると感じています。

 

以上、#今年読んだ一番好きな論文2020, 12/20の記事でした!

少しでも面白いと思っていただけたのであれば幸いです。紹介にあたって結構端折った部分も多いので、興味ある方はぜひ本文も目を通して見てください!

 

(修正) 2020/12/21 13:14 Figure 2が間違っていたので修正しました。 

*1:bump-and-hole法は本論文ではAllele-specific chemical geneticsと呼んでいるのですが、bump-and-holeの方がメジャーな呼び方だと思います。この手法の原典に興味がある方はこちらNature, 407, 395–401(2000)をどうぞ

*2:ヒストンタンパク質はdocr16sさんもこのアドベントカレンダーで取り上げてて、ネタが被ってしまったな...